Identifying Eimeria spp. circulating in a poultry flock assists in designing vaccine preventive programs, as different species do not cross-protect. Because species differ in anticoccidial drug susceptibility, species identification can also be used to optimize anticoccidial medication. In the present study, we designed pan-Eimeria-specific primers for the 18S rDNA and the cytochrome oxidase I (COI) genes, and tested whether next-generation sequencing of their amplicons allowed reliable identification of Eimeria spp. in samples of isolated oocysts. For each gene, two sets of primers to be used in a nested PCR (nPCR) system were designed. In silico evaluation of the primers using published sequences showed that nucleotide sequence identities of the nested amplicons were less than 97% between most species, while only identities of 18S rDNA genes of Eimeria necatrix and Eimeria tenella and between the COI genes of Eimeria mitis and Eimeria mivati were higher than 97%. Three vaccines and five Eimeria samples from chickens in backyard flocks were investigated by nPCRs and by direct PCRs (dPCR) using the nested (inner) primers with genomic DNA as the template. Seventeen further Eimeria samples from chickens in backyard flocks and three Eimeria samples from commercial broiler flocks were investigated only by nPCR. Sequencing nPCR products tended to detect more species than sequencing dPCR products and sequencing 18S rDNA products tended to detect more species than sequencing COI products. Regarding the detected species, there was a clear difference between the commercial broiler flocks and the backyard flocks. Eimeria acervulina, Eimeria maxima, and E. tenella/E. necatrix were the only species detected in broiler flocks, while the population in the backyard flocks was more varied, with Eimeria brunetti and E. mitis/E. mivati and the previously described operational taxonomic unit Y being more prevalent. Several sequences having less than 97% identity with one of the sequences used for clustering were detected in samples from backyard flocks. In conclusion, next-generation amplicon sequencing can be a useful tool to determine which Eimeria spp. are circulating in chicken flocks.
Evaluación de la secuenciación de nueva generación de amplicones para identificar Eimeria spp. de pollos. La identificación de Eimeria spp.que está circulando en una parvada avícola ayuda a diseñar programas preventivos de vacunas, ya que entre las diferentes especies no existe protección cruzada. Debido a que las especies difieren en la susceptibilidad a los medicamentos anticoccidiales, la identificación de especies también se puede utilizar para optimizar la medicación anticoccidial. En el presente estudio, se diseñaron iniciadores específicos genéricos de Eimeria para los genes de ADNr 18S y de citocromo oxidasa I (COI) y se evaluó si la secuenciación de nueva generación de los amplicones permitía la identificación confiable de Eimeria spp. en muestras de ooquistes aislados. Para cada gene, se diseñaron dos conjuntos de iniciadores que se utilizaron en un sistema de PCR anidado (nPCR). La evaluación in silico de los iniciadores usando secuencias publicadas mostró que las identidades de la secuencia de nucleótidos de los amplicones anidados eran inferiores al 97% entre la mayoría de las especies, mientras que solo las identidades de los genes de ADNr 18S de Eimeria necatrix y Eimeria tenella y entre los genes de citocromo oxidasa I de Eimeria mitis y Eimeria mivati fueron superiores al 97%. Se analizaron tres vacunas y cinco muestras de Eimeria de parvadas de pollos de traspatio con el sistema de PCR anidado y con PCR directa (dPCR) utilizando los iniciadores anidados (internos) con ADN genómico como modelo. Diecisiete muestras adicionales de Eimeria de parvadas de pollos de traspatio y tres muestras de Eimeria de parvadas de pollos de engorde comerciales fueron analizadas solo por PCR anidada. La secuenciación de productos PCR anidada tendió a detectar más especies que la secuenciación de productos por el método directo de PCR y la secuenciación de productos de ADNr 18S pareció detectar más especies que la secuenciación de productos de citocromo oxidasa I. Con respecto a las especies detectadas, hubo una clara diferencia entre las parvadas comerciales de engorde y las parvadas de traspatio. Eimeria acervulina, Eimeria maxima y E. tenella/E. Necatrix fueron las únicas especies detectadas en las parvadas de engorde, mientras que la población en las parvadas de traspatio fue más variada, con Eimeria brunetti y E. mitis/E. mivati, también la unidad taxonómica operativa Y descrita anteriormente fue más prevalente. Varias secuencias con menos del 97% de identidad con una de las secuencias utilizadas para la agrupación fueron detectadas en muestras de parvadas de traspatio. En conclusión, la secuenciación de nueva generación de amplicones puede ser una herramienta útil para determinar que especies de Eimeria spp. están circulando en parvadas de pollos.
Keywords: Illumina sequencing; coccidia; diagnosis.